馬云飛和高寒婚禮的當天，來了一個不速之客——“五號特工組”的老朋友老于，懇請他們再次出山，執行一項別人無法完成的任務：追查盜竊美國核武器資料的雙料間諜吉川猛夫。為此，高寒做了落跑新娘，跟隨歐陽劍平和李智博趕赴云南接受任務，馬云飛和何堅也被迫出山，于是“五號特工組”五位成員：語言專家歐陽劍平、爆破專家李智博、特工馬云飛、密碼專家高寒、“神偷”何堅再次集結上了前線。同時，日本方面派出了他們的殺手锏，酒井朝香——她是酒井美惠子的親妹妹，一個手腕更加毒辣兇狠的高級女間諜。
“五號特工組”出師不利，被吉川猛夫還沒有暴露的同伙陷害入獄，五號無奈之下集體越獄……一面躲避美軍的追捕，一面追擊吉川猛夫，最終揪出了美軍內部的叛徒，搶在酒井朝香之前找到了失竊的核武器資料。
戰事愈演愈烈，前方戰場的士兵出現了大規模病毒感染，五號特工組受命調查，路上和這場病毒站的禍首橋本失之交臂。橋本還是個視科學試驗高于一切的科學怪人，他給高寒注射了病毒，把她當試驗品綁架走，一路細心的保護研究。馬云飛、李智博、何堅深入滇緬邊境，經過艱難的叢林追擊戰，摸到了敵人在緬甸境內的生化基地。此時，高寒為了拿到病毒血清，街救前線的大批戰士，也差點獻出了生命。
戰事緊急，正面戰場物資短缺。蔣介石盯上了閻錫山早年私藏的軍火，閻錫山以軍火庫建造者李陽失蹤為由，不為蔣介石提供軍需。戴笠不得不再次求助于五號特工組，讓馬云飛四人潛入山西，尋找軍火庫建造者李陽的下落。五號特工組利用日軍司令風間義博嗜愛中國畫的喜好，竊得蔣介石家里的古代名畫為誘餌，釣了風間義博上鉤。籍由賣畫，深入風間義博居住的司令部，趁機偷拍日軍晉中會戰戰斗記錄和花名冊，此時酒井也來了，馬云飛巧妙周旋，在被識破的前夕，順利逃出日軍司令部。五號按圖索驥，馬云飛、何堅通過假招供的手段，進入康坑歸化監獄。倆人費盡周折，終于取得了監獄里犯人領袖朱非的信任，協助他越獄。朱非行動失敗，臨死前告訴馬云飛，自己就是李陽，五號終于搶在日本人之前找到軍火庫。
五號特工組帶著宋美齡心愛的國畫回到重慶，準備完璧歸趙，一下飛機就碰到了來華援助的美國飛虎隊隊長陳納德在機場遇襲。五號特工組沒來得及脫身，被老于和戴笠堵在了門口。五號從重慶機場槍擊現場查起，利用物理、槍械等知識，依靠心理學和推理演繹等手段，從極為有限的線索中還原了槍擊現場，并沿著蛛絲馬跡，徹底瓦解了日本人了刺殺陰謀。揭開真相后，馬云飛等人奉命保護陳納德來重慶；陳納德夫人為了確保陳納德安全，還請來了美國的安全顧問羅特。羅特到達后，對馬云飛等人的行動多有指責，而層出不窮的意外，也讓五號特工組屢屢陷入被動。馬云飛等人幾經周折，發現一切事件的真兇，是安全顧問羅特造成的——這家伙是個冒牌貨。
五號特工組接到中國遠征軍孫立人將軍的邀請，送一份重要的河道圖去緬甸，和他們通行的還有隨行記者崔媛媛，馬云飛的老同學，高寒為此吃醋不已。他們都不知道此時的崔媛媛其實是易容后的酒井朝香，酒井殺害并冒充崔媛媛跟著五號的目的是混入遠征軍基地，配合日本轟炸機實施轟炸。只有高寒一個人識破了崔媛媛的面目，其他人卻都認為她是在吃醋起疑，不相信她的話。當大家一個個被易容的酒井送進陷阱，指引日本轟炸機的篝火即將被點燃的時候，離隊許久的歐陽劍平帶著陳納德的救援趕到。酒井朝香重蹈了她姐姐的命運，五號特工組又一次團聚，高寒和馬云飛這一對戀人卻成為了陌路。
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